PCR-Uracil 을 이용한 Site-directed mutagenesis 실험 방법 정리

Site-directed mutagenesis

• Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열을 변화시켜, 어떤 단백질의 기능부위를 연구할 때에 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 혹은 제거한 다음 기능의 변화를 관찰함으로써 기능부위를 규명할 수 있는 분자생물학에서 중요하게 이용되는 분야이다.
•  DNA 재결합시 필요한 제한효소 절단부위를 만들거나 소실시킬 때 사용하기도 함.
•  promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화 시켜서 결합을 못하게 한 다음 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting factor의 중요성을 타진할 수도 있다.
• 이상과 같이 site-directed mutagenesis는 여러 분야에 적용되는 강력한 도구가 되었으며, 여러가지 방법이 개발되어 소개되었다. 

아래 대표적인 3가지 방법 중 두번째 방법을 소개하고자 함.

첫번째로 Stratagene 회사에서 개발하여 판매하는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit를 이용한 방법

두번째 방법은 uracil를 함유한 single-stranded DNA를 이용하는 방법

세번째 방법은 PCR을 이용하여 mutation을 함유한 DNA fragment를 만들어 subclone을 제조하는 방법

 

 

Uracil을 함유한 phagemid ssDNA를 template로 한 site-directed mutagenesis

 

* 실험재료

1. E.coli strains

    a. CJ236 : dut-, ung-이고 chloramphenicol 내성 유전자를 marker로 한 F' episome을 가지고 있어

                     phagemid ssDNA를 만들어낼 수 있다.

     b. Wild type dut+, ung+ strain으로서 DH5α, JM109, NM522, XL1-Blue 등을 모두 이용할 수 있으며,

                     F' episome을 함유할 필요는 없다.

2. Helper phage: M13K07 혹은 VCSM13 helper phage로서 1011~1012 phage particle/ml 이상의 titer 

3. Kanamycine(75 mg/ml, -20°C)

4. PEG/NaCl(20% PEG 6000 혹은 8000, 2.5 M NaCl)

5. T4 polynucleotide kinase(10 U/μl)

6. 10x kinase buffer(0.5 M Tris-Cl, pH 7.5, 0.1 M MgCl2, 50 mM DTT, 0.5 mg/ml bovine serum albumin)

7. T4 DNA polymerase

8. 10x T4 DNA polymerase buffer

9. dNTP mix(10 mM, each)

10. ATP(10 mM)

11. Mutagenic primer : phagemid ssDNA에 상보적인 염기서열로서 20mer 이상이며,

                                    mutation이 중앙 부위에 위치하게 한다. 농도는 10 pmoles/μl로 한다.

 

*Uracil을 함유한 single-stranded phagemid DNA 분리

1. Plasmid를 CJ236에 transformation시킨 후 한 개의 colony를 3 ml TB medium에 접종한다.

2. Helper phage 10 μl를 첨가하고 37°C에서 2시간 배양한다.

3. Kanamycine을 3 μl 첨가하고 계속하여 밤새 배양한다.

4. 배양액 1.4 ml을 1.5 ml-eppendorf tube에 옮긴 뒤 14,000 rpm에서 5분간 원심분리하여

   상층액을 새 tube에 옮긴다. 다시 5분간 원심분리하여 1.2 ml 상층액을 새로운 tube로 옮긴다.

5. 상층액 1.2 ml에 300 μl의 PEG/NaCl 용액을 첨가하고 섞는다. 얼음에서 30분간 방치한 후에 

   14,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 phage 침전을 얻는다. 다시 짧게 원심분리하여 남아있는 용액을 모두 제거한다.

6. 침전물을 150 μl의 TE 용액에 부유시킨 후, 150 μl의 phenol을 첨가하고 진탕한다.

    원심분리를 14,000 rpm에서 10분간 하여 상층액을 얻는다.

    다시 150 μl의 chloroform을 넣고 진탕하여 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 얻는다.

7. 3 M sodium acetate 용액 15 μl를 첨가한 후에 300 μl의 ethanol을 첨가하여 -20°C에서 15분 방치한다.

   원심분리를 14,000 rpm에서 10분간 하여 DNA를 침전 시킨다.

   침전물은 다시 짧게 원심분리하여 남아있는 용액을 완전히 제거한다. 침전물은 50 μl의 TE에 용해시킨다.

 

==> 이상과 같이하여 얻은 ssDNA는 보통 10 μg 정도로, 전기영동상 helper phage ssDNA와 phagemid ssDNA, 두개의 주된 band를 관찰할 수 있다.

 

* Primer phosphorylation , DNA duplex formation, and transformation

1. 아래와 같이 반응액을 섞은 후 37°C에서 1시간 30분 방치한다.

• 10x kinase buffer 2 μl
• Mutagenic primer(100 pmoles/μl) 1 μl
• 10 mM ATP 2 μl
• H2O 14 μl
• T4 polynucleotide kinase(10 U/μl) 1 μl

2. 반응을 멈추기 위하여 75°C에 15분간 방치한다. 간단히 원심분리하여 내용물을 tube 바닥으로 모은다.

3. 새로운 시험관에 아래와 같이 반응액을 만든다.

• 10x T4 DNA polymerase buffer 1 μl
• Uracil-containing ssDNA 2 μl
• Phosphorylated mutagenic primer 1 μl
• H2O 6 μl

4. 75°C의 heat-block에 tube를 넣고 block을 chamber에서 꺼내어 상온에서 서서히 식도록 한다.

5. Block의 온도가 35°C 정도까지 떨어지면 얼음에서 옮겨 식히고, 간단히 원심분리하고 내용물을 바닥으로 모은다.

6. 아래와 같이 첨가하여 섞은 뒤 37°C에서 2시간 방치한다.

• 10x T4 DNA polymerase buffer 1 μl
• 10 mM ATP 2 μl
• 2.5 mM dNTP 4 μl
• T4 ligase 1 μl
• T4 DNA polymerase 1 μl
• H2O 1 μl

7. 이 용액 5~10 μl로 XL1-Blue competent cell을 transformation 한다.