초보 연구자들도 쉽게 할 수 있는 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining) 실험 방법 - 요약 및 정리

오늘은 in vitro 실험에서 빠질 수 없는 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining) 실험 방법을 소개하고 설명 및 요약하도록 하겠습니다.

 

실험 목적은 아래와 같습니다.

1. 일반적으로 타겟 단백질이 세포내 어느 위치에 존재하는지 확인 

2. 외부 유전자를 발현시킨 단백질에 제대로 발현하는지 확인

3. 단백질 상호간의 관련성 (interaction) 을 확인

4. 1,2,3 번 모두를 동시에 확인 및 검증

ONCOLOGY LETTERS 19: 3907-3196, 2020 발췌

 

실험방법은 아래 세가지 조건에 따라 조금씩 다릅니다. 참고하시기 바랍니다.

 

1. 세포 배양/성장 형태, 즉 부유 / 부착 (suspension / adhesion) 세포에 따라 적용되는 방법

2. 대상 단백질의 세포내 (혹은 예상되는) 위치가 세포질 / 핵 / 세포막 (cytosol / nuclear / membrane) 따른 적용 방법

3. 검출 방법이 형광(Fluorescence) / DAB 발색 에 따른 적용방법 등

 

가장 일반적인 부착세포의 세포질 또는 핵에 존재하는 단백질을 염색하는 방법입니다.

 

Materials (준비해야 할 시약)

1. PBS (for 1liter)
    NaCl 8g
    KCl 0.2g
    Na2HPO4 1.44g
    KH2PO4 0.24g
    To 1liter (pH 7.4)

2. Paraformaldehyde

3. NP-40 or Triton X-100

 

Procedure (실험 과정 요약)

1. Fixation

 ① Wash twice with PBS.
 ­ ② Fix the cells with 4% Paraformaldehyde in PBS for 20 min.

       - 100% MtOH (메탄올), 또는 MtOH : Aceton = 1:1 도 가능합니다.

         (1st Ab. data sheet / applied methods 참고하셔서,

          해당 Ab 는 "FIX 시 MtOH 불가능" 이란 내용 유무를 꼭 확인하시기 바랍니다.)
  ③ Rinse three times with PBS (or in PBS at 4℃ for 1-2 days)

 

2. Permeabilization

  ① Permeabilize with 0.5% NP-40 in PBS for 5 min (in case of cytosolic protein).

      (use triton X-100 in case of nuclear protein)-매우 중요합니다. ^^

  ② Rinse three times with PBS at 4℃ (storage possible)

 

3. Immunostaining

① Block with 15% normal serum (in 0.5~1.0% BSA in PBS) for 1hr at RT.
     (5% horse serum + 5% goat serum + 5% sheep serum) -  5% BSA 로 대체하셔도 됩니다.
­② Incubate with primary Ab (in 0.5~1.0% BSA in PBS) for 1hr at 37℃.
③ Wash three times with PBS.
④ Block with 15% normal serum (in PBS with 1% BSA) for 30 min at RT.

    -  5% BSA 로 대체하시거나 skip 하셔도 됩니다.
⑤ Incubate with 2nd Ab (in 5% normal serum in PBS) for 30 min at RT.

    - 1% BSA 로 대체하실 수 있습니다. (background 가 강할 수 있습니다. 참고하세요)
⑥ Wash three times with PBS.
⑦ Mount with 90% glycerol containing DAPI.

   - DAPI (Final conc. 0.1~1 µg/ml in PBS) 염색 후 wash 후 mounting 하시기를 추천합니다.

 

 

다음에는 위에 제시한 세포의 조건별 (1, 2, 3번) 추가 또는 삭제되어야 하는 과정들을

구체적으로 서술하고 주의 사항을 기술하도록 하겠습니다. 

 

즐거운 연구/실험실 생활 되세요~ ^^