쉽게 할 수 있는 ICC staining 실험 - 세포 표면 단백질 염색 방법

일반적으로 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining)을 수행하는 목적은 세가지 입니다. 첫번째는 타겟 단백질의 세포내 위치 확인하기 위해서, 두번째는 발현시킨 외부유전자의 발현을 확인하기 위해서, 마지막으로 세번째는 2가지 이상의 단백질의 상호간 관련성 (interaction)을 확인 및 검증하는 것입니다. 물론, 한꺼번에 모두 확인할 수도 있습니다.

 

세포 배양 / 성장 형태, 즉 부유 / 부착 (suspension / adhesion) 세포에 따라, 그리고 타겟 단백질의 발현 위치(세포내)에 따라 적용되는 실험 방법이 조금씩 다릅니다.

이번에는 “현탁액에서 고정되지 않은 세포에 표면 단백질 염색방법” (FACS 적용가능)을 설명합니다.

 

현탁액에 고정되지 않은 세포 표면 단백질 염색방법

-  "부착세포의 세포내/핵 단백질 염색" 은 일반적인 ICC 실험 방법 링크 참조하세요. ^^

 

J Korean Med Sci 2006; 21: 379-84. figure 2.  발췌

 

1. PBS 로 세척된 세포 현탁액 1ml를 15ml 원심분리기 튜브에 넣고 X 200g에서 5분간 세포를 수거합니다.

 

2. 상층액을 버리고 PBS에 희석한 1차 antibody 50-100 ul을 추가합니다.

   (참고: 해당 Antibody 의 datasheet 를 참고하시거나, 적정한 희석 배율을 사용하시면 됩니다. 일반적으로 적정 농도는 10-20 ug/ml 범위입니다. Santcruz 제품 기준으로 1:200~1:500 입니다.)

 

3. 손가락으로 튜브 바닥을 튕겨서 이 소량의 용액에 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다.

 

4. 30분 동안 얼음 위에서 반응시킵니다. (4℃ 가능) - ※아주 중요

 

5. 세포를 PBS로 세 번 세척하고 X200g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 따라냅니다.

 

6. 형광(FITC, Taxes Red 등) 접합 2차 antibody 50-100 ul을 추가하고 빛을 차단한 상태로 얼음 위에서 30분간 반응시킵니다. (4℃ 가능) - ※아주 중요

 

7. 세포를 PBS로 3회 세척하고 200g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 버리고, 세포를 두 방울의 PBS에 다시 현탁합니다

(*참고: 다음 단계에서 적절한 수의 검사를 용이하게 하기 위해 이 단계에서 세포를 농축하는 것이 중요).

 *ICC 경우 1 X 10^4 ~ 5 X 10^4 cells in PBS 2 drop (약 20~50ul)

 *FACS 경우 1 X 10^5 ~ 5 X 10^5 cells/1ml in PBS  (FASC analysis - 10,000 counting 기준) ==> 9. 번으로 이동.

 

8. 커버슬립이 있는 슬라이드(일체형)에 세포를 분주하거나 (잘 팔지 않습니다. ^^)

   일반 슬라이드에 1 drop 떨어뜨리고, mounting sol. (90% glycerol in PBS) 1 drop 추가한 후 커버슬립을 덮어 고정합니다.

 

9. 사용한 형광물질(2차 Antibody)에 적합한 필터를 사용하여 형광 현미경 이미지 확인

    (또는 FACS를 수행합니다.)

 

(※아주 중요 참고: 항체 분자는 살아있는 세포의 세포막을 투과하지 못하므로 내부 전체에 형광이 나타나는 세포는 모두 죽은 것입니다. 세포를 차갑게 유지하거나 0.1% 아자이드 나트륨으로 유지하지 않으면 캡핑이 발생하여 항체-항원 복합체가 세포막의 한 영역에 모여 초승달 모양의 형광 라벨링 패턴이 생깁니다).

 

※ 2개이상의 단백질 염색은 1차 Ab 의 source 가 다른것으로 (mouse / rabbit 또는 mouse / goat 추천) 사용

   2차 Ab 는 각각 green, red 계열을 사용하시면 됩니다.

 

질문 사항이 있으시면, 아래 댓글(비공개) 남겨 주시면 답변드리겠습니다.

 

즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!