Cell cycle analysis [FACS - PI staining] 실험 방법 정리

@ Cell cycle analysis 란? (자세한 설명은 생략)

    - 세포내 DNA 를 PI 로 염색하여 FACS로 분석하는 방법

Basics of DNA Cell Cycle Analysis (ww.phoenixflow.com) 발췌

 

I. preparation of PI staining

-  Wahing buffer : 2% FBS in PBS (or 2% BSA in PBS) / PBS 만 사용 가능

- 1.12% sodium citrate buffer (pH 8.5)

- RNase A (50ug/ml in 1.12% sodium citrate buffer pH 8.5)

- PI solution (BD Pharmingen Cat. #550825)

  * PI solution 조성 (만들어 사용 가능)

    PI 50 ug/ml (stock sol. 5 mg/ml)

    Sodium citrate 0.1 % (stock sol. 10%)

    NP-40 0.3%

    RNase 50 ug/ml (stock sol. 10 mg/ml)

    Adjust vol. 10 ml with 1x PBS

 

II. PI staining procedure (FACS sampling)

1. Cell (1 X 10^6 / 100Φ dish or T75 flask) seeding

    10% FBS Media 로 seeding (Over Night; O/N) 후 cell 이 잘 붙었는지 확인.

      **경우에 따라서 ⇒  serum free media로 change (synchronize 시킴)

 

2. Drug, Radiation, or Virus (2~5% FBS Media 사용)

      ⇒ virus infection시에 MOI를 다른 실험 보다 낮춘다…결과 좋게 나옴…

 

3. 1~3일 or 최장 5일 (sampling 할 날짜…)

 

4. Washing X 2회

  (Media 는 suction 하지 말고, 떨어진 세포도 모두 회수하기 위해 spin down)     

 

5. Trypsinization 하여 cell을 harvest..    

 

6. Centrifuge (swing rotor 사용할것 ; 850 x g, 5 min, 4 ℃)  

 

7. Cell pellet tapping

  7-1. (optional step) cell pellet 양이 여유가 있을 경우 Washing 한번 더 해주면 좋음

 

8. 70% ethanol 3 ml 첨가. (or PBS : EtOH = 1 : 2)

     ⇒ Vortex를 mild하게 하면서..에탄올을 한 방울씩 천천히 떨군다..

 

9. 4℃에 보관..(최소 1 hr 이상..)⇒ 오래두면 좋다. (최대 2주 동안 storage 가능)

 

10. FACS 분석 하고자 하는 날에..FACS tube로 옮긴다..

 

11. Washing X 2번..(Cfg. 850 x g에서 5 min)

 

12.  PI/RNase staining buffer [(BD Pharmingen Cat. #550825) ; 500 ul/1X10^6 cells]

     ⇒  Room Temp. (RT; 25℃ )에서 15~25min 반응시킨다..(30min을 넘기지 말 것/)

    또는 

   12-1 - 250ul RNase A  incubate 37℃ 30min

   12-2 - Add 250 PI sol. 37℃ 20min (1 X PI sol. in 1.12 sodium citrate buffer pH8.5)

 

13.  FACS anolysis (protect from light)

     또는, protect from light, store at 4℃ (최대 일주일까지 가능)

 

## 더 자세한 내용은 아래 링크 참조 ##

https://www.abcam.com/protocols/flow-cytometric-analysis-of-cell-cycle-with-propidium-iodide-dna-staining