PCR-4primers 를 이용한 Site-directed mutagenesis 실험 방법 정리

Site-directed mutagenesis

• Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열을 변화시켜, 어떤 단백질의 기능부위를 연구할 때에 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 혹은 제거한 다음 기능의 변화를 관찰함으로써 기능부위를 규명할 수 있는 분자생물학에서 중요하게 이용되는 분야이다.
•  DNA 재결합시 필요한 제한효소 절단부위를 만들거나 소실시킬 때 사용하기도 함.
•  promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화 시켜서 결합을 못하게 한 다음 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting factor의 중요성을 타진할 수도 있다.
• 이상과 같이 site-directed mutagenesis는 여러 분야에 적용되는 강력한 도구가 되었으며, 여러가지 방법이 개발되어 소개되었다. 

아래 대표적인 3가지 방법 중 세번째 방법을 소개하고자 함.

첫번째로 Stratagene 회사에서 개발하여 판매하는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit를 이용한 방법

두번째 방법은 uracil를 함유한 single-stranded DNA를 이용하는 방법

세번째 방법은 PCR을 이용하여 mutation을 함유한 DNA fragment를 만들어 subclone을 제조하는 방법

 

 

실험방법

* 실험재료

1. 10x reaction buffer

2. Oligonucleotide: 그림에서 보는 P1, P4는 mutation 부위로부터 5' 혹은 3' 쪽의 primer로서 plasmid의 sequencing primer를 사용하여도 무방하다. Mutagenic primer인 P2와 P3는 20 base 정도가 complementary 하여야 하며, mutation 위치는 complementary한 부위의 중앙에 위치하게 한다. 각 primer의 농도는 50 pmoles/μl로 한다.

3. dNTP mix(10 mM, each)

4. Template DNA: plasmid DNA를 사용할 수 있으며, 농도는 10 ng/μl로 만든다.

5. Taq polymerase (2.5 U/μl)

 

* PCR 수행 조건  

1. 아래와 같이 두 개의 PCR tube에 반응액1과 반응액2를 준비한다. (그림 참조)

 

반응액1

• 10x reaction buffer : 5 μl
• dNTP mix (2.5mM) : 1 μl
• Template DNA : 1 μl (약 10~20ng/ul)
• Primer P1 / P2 (20 pmole) : 각각 0.5 μl 
• D.W : 41 μl
• Taq polymerase : 1 μl

반응액2

Primer P1 과 P2 대신에 primer P3 와 P4 를 사용하고 그 외는 반응액1 과 동일하다.

 

2. 1차 PCR을 아래와 같이 시행한다.

   94°C에서 5분 1회,

   94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1분(template 길이에 따라 적당히 조절한다.), 25회,

   72°C에서 10분

 

3. 반응액1과 반응액2를 이용하여 2차 PCR을 시행한다.

•    10x reaction buffer 5 μl
•    dNTP mix 1 μl
•    반응액1과 반응액2 각각 1 μl
•     Primer P1과 P4 각각 0.5 μl
•     H2O 40 μl
•     Taq polymerase 1 μl

 

94°C에서 5분 1회,

94°C 30초, 55°C 30초, 72°C 1분(template 길이에 따라 적당히 조절한다.), 25회,

72°C에서 10분

* 1차 PCR에서 증폭한 DNA는 agarose gel electrophoresis로 분리하여도 좋으나 바로 사용하여도 무방하다.

 

4. 2차 PCR에서 증폭된 DNA를 plasmid vector에 subcloning 한다

 

5. Transformation (E. coli 등)