PCR-Dpn I 을 이용한 Site-directed mutagenesis 실험 방법 정리

Site-directed mutagenesis

• Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열을 변화시킴을 의미하는, 분자생물학에서 중요하게 이용되는 분야이다. 즉 어떤 단백질의 기능부위를 연구할 때에 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 혹은 제거한 다음 기능의 변화를 관찰함으로써 기능부위를 규명할 수 있다.
• 또 DNA 재결합시 필요한 제한효소 절단부위를 만들거나 소실시킬 때 사용되기도 한다.
• 또한 promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화 시켜서 결합을 못하게 한 다음 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting factor의 중요성을 타진할 수도 있다.
• 이상과 같이 site-directed mutagenesis는 여러 분야에 적용되는 강력한 도구가 되었으며, 여러가지 방법이 개발되어 소개되었다. 그 중에서 구체적인 실험 방법은 그중 간단하고 가장 많이 사용되고 있는 Site-directed mutagenesis (with PCR-Dpn I) 제시하고, 대표적인 3가지 방법만을 소개하고 자 한다.

 

 

Site-directed mutagenesis (with PCR-Dpn I)

• 실험 재료

1. Pfu DNA polymerase(2.5 U/μl)
2. 10x reaction buffer[100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-Cl, pH 8.8, 20 mM MgSO4, 1% Triton X100, 1 mg/ml bovine serum albumin]
3. Oligonucleotide primer: 원하는 mutation을 가지고 있는 서로 상보적인 두개의 primer가 필요하다. 보통 primer 크기는 30mer 내외로 하고 mutation 위치는 중앙에 위치하게 한다.
4. dNTP mix(10 mM, each)
5. Competent cell
6. Dpn I(10 U/μl)

 

 

• 실험 방법

1. 아래와 같이 반응액을 PCR tube에 준비한다.

      10x reaction buffer 5 μl

       Plasmid DNA(10 ng/μl) 1 μl

       Oligonucleotide primer #1(10 pmole/μl) 1.25 μl

       Oligonucleotide primer #2(10 pmole/μl) 1.25 μl

        dNTP mix 1 μl

        ddH2O to 50 μl

2. 최종으로 Pfu DNA polymerase를 1 μl 첨가하고 섞은 후 PCR을 시행한다. PCR cycle 온도와 시간은 아래와 같이 한다.

        95°C 30초, 1회

        95°C 30초, 55°C 30초, 68°C 10분, 15회

        4°C 보존

3. 반응이 종료되면 Dpn I(10 U/μl) 효소 1 μl를 직접 PCR 반응액에 첨가하고 섞은 후, 37°C에서 1 시간 반응시킨다.

4. Dpn I을 처리한 용액 1 μl로 XL1이나 DH5α 등의 E.coli에 transformation 시킨다.

 

 

 

첫번째 : Stratagene 회사에서 개발하여 판매하는 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit를 이용한 방법

(상기 소개된 실험 방법이다.)

• 모두 6시간 정도가 소요된다. Mutation을 가진 두개의 상보적인 염기서열의 oligonucleotide를 primer로 사용하고, plasmid 상태의 DNA를 template로 사용하여 새로이 mutation을 가진 plasmid를 시험관에서 증폭, 합성한 다음, 원래의 wild type은 Dpn I 제한효소로 절단하여 제거하는 방법이다.
• 보통 실험실에서 사용하는 E.coli는 Dam methylase를 가지고 있어서 이들에서 분리된 모든 DNA의 경우 GATC 염기서열의 A가 methylation 되어있다. 즉 template로 사용한 wild type DNA는 E.coli에서 분리된 DNA로서 Gm6ATC를 인식하여 절단하는 Dpn I에 의하여 절단되지만 시험관에서 합성한 mutant DNA는 절단되지 않는다.
• Dpn I으로 처리한 DNA를 E.coli host에 transformation 시킴으로써 높은 확률로 mutant를 가진 clone을 얻을 수 있다.

 

두번째 :  uracil를 함유한 single-stranded DNA를 이용하는 방법

• 두개의 중요한 DNA repair 효소인 dUTPase(dut)와 uracil N-glycosylase(ung) 유전자의 결함이 있는 E.coli strain에서는 thymine 대신에 소량의 uracil을 함유한 DNA가 합성되게 된다.
• 이와 같은 dut-, ung- strain에서 만든 single-stranded phagemid DNA를 template로 하고 mutation을 함유한 oligonucleotide를 primer로 시험관내에서 double-stranded circular DNA를 합성하여 wild type E.coli에 넣어주게 되면, 두 가닥의 strand 중에 uracil을 함유한 phagemid DNA는 선택적으로 제거되고 시험관에서 합성된 DNA가 template로 이용되어 복제가 일어난다.
• 이 방법은 비교적 비용이 적게 든다는 장점이 있지만, uracil이 함유된 ssDNA를 제조하여야 한다는 불편함이 있다.

 

세번째 : PCR을 이용하여 mutation을 함유한 DNA fragment를 만들어 subclone을 제조하는 방법

• 네개의 primer를 합성해야 하므로 비교적 비용이 많이 드나 요즘 oligonucleotide 합성 가격이 내려가서 비용 부담이 적어졌다.

## 세가지 방법 모두 하루에 transformation까지 할 수 있고 높은 성공률을 보장하므로 어떤 방법을 이용하여도 안전하다.