RNA 정량 (RNA 농도 측정) 방법 및 요약 정리

DNA, RNA 정량 방법 (UV-Vis spectrophotometer 사용)

분리 정제된 DNA 또는 RNA 를 정량할 수 있는 방법으로 UV 파장대 (260/280nm) 의 흡광도를 측정하여 제시된 계산식에 의해 농도(ug/㎖ or ng/㎕)을 산출할 수 있다.

분리 정제된 DNA, RNA 는 실험실 수준의 UV-Vis spectrophotometer 또는 nano-drop 장비로 측정이 가능하지만, ssDNA, ssRNA, oligomer 등은 산출은 가능하지만, 정확한 계산 또는 측정의 오차가 있으므로 해당 장비보다 정밀하고 고가의 장비를 사용하는 것을 추천한다.

참고로, RT kits 로 합성된 cDNA 의 농도는 측정 할 수 없으므로 합성 전 사용된 total RNA 의 양을 기준으로 실험을 진행할 것을 추천한다.

RNA 정량

(1)   RNA pellet을 0.1% DEPC water로 녹이고 resuspension한다.

(2)   sample 2㎕를 취해 0.1% DEPC water 1㎖을 가해(500배 희석) UV로 정량한다.
         (OD260= 1은  40 ug/㎖ or 40 ug/ul)* – 방법은 DNA 와 동일

         260/280 (ratio)가 1.7-2.0사이이면 purity가 좋은것이다.

      * dsDNA = 50 ug/㎖

        ssDNA =  33 ug/㎖

        ssRNA = 40 ug/㎖  

        oligonucleotide = 20~30 ug/㎖

 

예시)  파장 260nm에서 흡광도가 1이면 RNA 1ml당 40㎍의 RNA가 있다고 가정하므로
       1(흡광도) : 40 ㎍/㎖ = 0.0114(흡광도) : χ
           ∴ χ = 0.0144 x 40㎍/㎖ = 0.456㎍/㎖
그런데 500배 희석해 주었으므로 500곱해주고 단위를 맞춰주면
농도는 0.456㎍/㎖ × 0.001 ㎖/㎕ × 500 = 0.228㎍/㎕ (228ng/㎕) 이다

 

RNA 확인

(1) RNA northern kit을 조립한 후 수평을 맞추고 DEPC water를 부어 놓는다.
(2) Agarose gel 40㎖을 만든다.
   * Agarose gel 조성
    1.2% agarose for RNA 0.48g
    10 × MOPS 4㎖
    DEPC water 33.5㎖
    1.1% formaldehyde 2㎖
(3) 잘 저어준 후 거품이 없어질 때까지 기다렸다가 gel을 붓고 굳힌다.
(4) RNA 10㎍에 loading buffer 2㎕를 가한다.
(5) 65℃에서 10분간 incubation한다.
(6) 1×MOPS를 붓고 40V에서 10～15분간 prerunning 시킨다.
(7) Well에 sample을 loading한다.
(8) 70V에서 90분간 running 시킨다.
(9) gel을 꺼내 RNA band를 확인하고, scan한다.

 

 

28S

 

 

 

18S