누구나 할 수 있는 동물 세포 배양 방법 (Cell culture) 정리 - 처음부터 끝까지 요약!

동물세포 (animal cell) 배양(culture ) 방법

 : 동물 세포 배양은 다양한 과학 및 생명공학 분야에서 여전히 중요한 도구로 사용되고 있으며, 해당 분야의 기술과 지식이 발전함에 따라 그 응용 분야가 지속적으로 확대되고 있습니다. 동물 세포 배양에 대한 몇 가지 일반적인 사항은 다음과 같습니다.

• 세포주: 동물 세포주는 배양에서 지속적으로 증식할 수 있도록 불멸화 또는 변형된 세포입니다. 
• 배지 및 배양 조건: 동물 세포는 성장을 위해 영양분이 풍부한 특정 배지와 적절한 온도, pH, 습도 등 환경 조건이 필요합니다.
• 무균 상태: 동물 세포 배양에서는 세포의 생존력과 무결성에 영향을 줄 수 있는 박테리아, 곰팡이 또는 기타 미생물에 의한 오염을 방지하기 위해 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다.
• 계대배양(subculture): 동물 세포는 일반적으로 기존 배양에서 소수의 세포를 신선한 배지가 있는 새로운 배양 용기로 옮기는 방식으로 하위 배양 또는 통과 배양됩니다. 이 과정은 세포 생존력을 유지하고 과밀화를 방지하기 위해 주기적으로 수행됩니다.
• 세포 분화: 동물 세포는 배양 조건과 사용된 특정 세포주에 따라 근육 세포, 신경 세포 또는 피부 세포와 같은 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 따라서 동물 세포 배양은 세포 분화 및 조직 발달을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
• 윤리적 고려사항: 동물 세포 배양은 동물에서 유래한 세포를 사용하기 때문에 윤리적 문제가 제기될 수 있습니다. 
• 응용 분야: 동물 세포 배양은 세포 과정을 이해하기 위한 기초 연구, 신약 발견 및 개발, 바이오 의약품 생산, 조직 공학, 재생 의학 등 다양한 분야에서 활용되고 있습니다.

 

1. Preparation of culture media

- Media : DMEM, RPMI1640, MEM, F-12, EBM, IMDM 등 세포주에 따라 다르다.

              (세포주의 종류에 따라 datasheet 확인하여 배양할것, 논문참조해도 됨)

- FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco #16000044) : final 10% in Media

- Antibiotics (peniciilin-streptomycin, Gibco #15140163) : final 1% in Media

Gibco 홈페이지 발췌

- PBS(-) : calcium, magnesium free Dulbeco's phosphate buffered saline (Sigma #D7030 10X1L)

 

- Trypsin-EDTA : 0.25% trypsin-EDTA in HBBS (Gibco # 100ml) dilution 1:5 PBS or D.W

 

2. Trypsinization & Subculture

- preconfluent flask

- remove media (Pasteure pipette 이용. Vacuum suction)

- Wash in PBS(-) : media vol. 에 1/2~1/3

- remove PBS (Pasteure pipette 이용. Vacuum suction)

- 0.05% trypsin-EDTA 첨가 : 37℃에서 5min. flask를 탕탕~ 친다. (Max. 5min) 현미경상에서 cell 이 흐르면 된다.

- enzyme inactivation : Media (complete)를 original vol. 첨가

- pipetting : for cell dispersion. (기포가 생기지 않도록)

- transfer conical tube then centrifuge at 1000~1500 rpm.

- resuspend cell pellet with 1ml complete media, then cell counting  (add media for 10^5 cell/ml)

- plate cell according to split ratio (1:3-1:4)

	6well	T25, P60	P100	T75, T80
PBS(-)	2ml	3ml	5ml	6-7ml
trypsin-EDTA	0.5ml	0.5-1ml	1-2ml	2-4ml
Media	2.5ml	5ml	10ml	15-20ml

 

3. Cell Freezing & Thawing

 

   # 준비물

• Cell freezing media (100 ml)

       - DMSO (CH3)2SO, dimethylsulfoxide 10ml

       - Fetal Bovine serum 30ml

       - Culture media 60ml

• preparation for trypsinization
• cryotubes of 1.8ml
• ice
• -70℃ deep freezer

 

  # cell freezing

• - trypsinization & centrifuge
• - resuspend cell pellert & centrifuge
• - discard supernatant by vacuum suction
• - rususpend cell pellet with freezing media(5 X 10^6 - 2 X 10^7 cells/ml)
• - transfer cell suspension to cryotubes : 1ml in each tube
• - sealing with parafilm
• - slow freezing : place styrofoam box in -70℃ deep freezer overnight
• - rapidly transfer crytubes to liquid nitrogen tank.

  # cell thawing

• - choose correct thbe from liquid nitrogen tank.
• - transfer to 37℃ water bath with a lid
• - 얼음이 하나 떠 있을 정도까지 녹으면 꺼내서 70% EtOH 로 washing
• - 1ml pipette 으로 conical tube 에 천천히 옮긴다. (남은 residue로 viability test 시행)
• - prewarmed media 9ml를 천천히 계속 흔들면서 첨가한다. (한방울씩)
• - centrifuge at 1000-1500 rpm 4℃ for 5min
• - vacuum suction
• - resuspend cell pellet.
• - plate cells to new flask (P60 3개 또는 T75 or P100 1개)
• - change media immediately after attachment(next day)

 

4. Cell Culture

- 암세포는 세포의 성장속도에 따라서 다르지만, 최장 5일까지 배양이 가능하다.

- 80% conflency (3-4 일째 subculture) 에서 1:4~10 으로 split 한다.

- 이틀에 한번씩 media change. (오늘chage-->모레 chage)