RNA (Ribonucleic acid) 란? 특징 및 구성은 아래와 같다.
- 전형적인 포유동물세포는 세포당 약 10-5 μg의 RNA를 함유하고 있다.
- ribosomal RNA (주로 28S, 18S, 5S) 80∼85%
- 여러 종류의 소분자 RNA(transfer RNA, small nuclear RNA 등) 10∼15%
- mRNA는 세포내 전체 RNA중 1∼5% 정도로 크기(수백개에서 수천개 염기)와 염기배열 순서가 다양하며, 거의 모든 포유동물의 mRNA에는 3'쪽 끝에 poly(A) tail이 있어 oligo(dT) cellulose를 이용한 affinity chromatography로 순수 분리할 수 있다.
RNase의 작용 최소화
- RNase 는 온도, pH 등의 극한 환경에서도 활성이 떨어지지 않기때문에 환경에서 RNase 가 작용할 수 있는 최소한의 노출이 필요하다.
- 4 M guanidine isothiocyanate와 β-mercaptoethanol 용액 내에서 불활성화된다.
- 이들 시약을 이용하여 RNA를 분리하면 RNase가 풍부한 췌장조직에서도 완전한 형태의 RNA를 분리할 수 있다.
* RNA 분리에 필요한 모든 시약은 DEPC를 처리한 증류수를 이용하여 제조.(매우 중요함)
- DEPC (diethyl pyrocarbonate) : RNase activesite의 histidine을 선택적으로 alkylation시켜 inactivation시킴 (DEPC는 발암물질로 추정)
- 증류수를 DEPC로 처리할 경우에는 DEPC를 0.1%(v/v)로 증류수에 첨가한 후 하룻밤 동안 stirring bar를 이용하여 계속 섞으면서 열을 가한다 (반드시 Humm Hood 에서 작업한다.
- 다음날 아침 증류수에서 DEPC 냄새가 나지 않으면 autoclave 하여 사용.
- 대부분의 용액은 용액을 모두 만들어 DEPC를 처리해도 되지만, Tris 등의 용액은 용액 속에 직접 DEPC를 넣으면 안되고 DEPC 처리한 증류수로 만들어야 한다.
@ RNA 정제는 대부분의 실험실에서 Trizol (invitrogen #15596-026) 또는 RNeasy mini kits (Qiagen ; 74104) 을 사용하므로, 두가지 정제방법에 대해 작성하고자 한다.
제시된 두가지 방법 모두 RNA 를 분리 정제하고자 하는 대상이 세포(in vitro) 또는 조직(in vivo) 모두 적용이 가능하지만, 작성자는 조직은 Trizol 을 세포는 Qiagen RNA kits 를 선호한다.
- Trisol reagent methods (invitrogen ; 15596-026, 2~8℃ storage)
Tiussue 사용시 추가 과정
- 무게를 재어 50mg 씩 2㎖ tube에 나눠 넣는다.
- **Polytron homogenizer 을 이용하여 간을 잘게 부순다.
- TRIzol reagent 1㎖을 가하고 실온에서 5분간 방치한다.
**Tissue lysate methods
1. 조직을 liquid nitrogen을 이용해서 동결시킨 다음 막자사발에 놓고 가는 방법
- 대량의 샘플을 이용할 때 비교적 쉬운 방법입니다.
2. Glass homogenizer를 이용해서 가는 방법
- 연조직일 때 거의 이 방법을 씁니다.
3. Polytron homogenizer를 이용해서 가는 방법
- 잘 갈리지 않는 조직은 칼날이 달린 이 기구를 이용해서 갈아야 할 때가 있습니다.
1. Trizol 1ml을 각 sample에 넣어준다. - cell membrane을 깬다.
2. Vortexing or 흔들어준다. 5분 상온에 둔다.
3. Centrifuge at 4℃, 12,000g, 10min (skip 가능)
4. Chloroform 0.2ml (trizol 1ml당 0.2ml) – vortexing 15sec
5. 2~3min 정도 층이 분리될 때까지 상온에서 둔다.
6. Centrifuge at 4℃, 12,000g, 10min
7. 상층액을 조심스럽게 400λ딴다.
8. isopropanol을 0.2ml, high salt를 0.2ml (trisol 1ml당 0.5 ml) – (gently) vortexing
9. 상온에서 15min incubate
10. centrifuge를 4℃, 12,000g, 10min
11. RNA pellet을 제외한 나머지 상층액을 조심스럽게 버린다
12. washing - 75% EtOH 1ml, 4℃, 12,000g, 5min
13. RNA pellet을 제외한 나머지 상층액을 조심스럽게 버린다.
14. pipette으로 물기를 제거
15. 상온 clean bench에서 RNA건조 (within 5min)
16. DEPC water elutio
- RNeasy mini kits (Qiagen ; 74104. Room temp. storage)
1. RLT buffer 에 β-mercapto ethanol 을 1/100 되도록 넣어준다.
2. Cell 은 media 를 모두 suction 하고 PBS 로 한 번 washing 해준다.
3. RLT buffer + β-mercapto ethanol 을 넣어주고,
(cell의 양이 1X10^7 이하면 350㎕를 넣어주고,
이상이면 700㎕를 넣어준다.)
Cell 이 뭉치지 않도록 잘 계속 inverting 해준다.
(Cell 이 마르지 않도록 PBS suction 하고 빠른 시간 안에
buffer 를 넣어준다.)
4. Room Temperature 에서 20~30 분 reaction 한다.
(시간을 오래 둘수록 DNA contamination 을 줄일 수 있다.)
5. 70% Ethanol 을 동일한 volume 으로 넣어주고 inverting 해준다.
6. Column 에 sample 을 loading 하고, 15sec. 10000rpm 이상으로 centrifugation.
7. RW1 buffer 700µl 넣어주고, 같은 조건으로 centrifugation.
8. 500µl RPE (+ Ethanol) buffer 를 넣어주고 같은 조건으로 centrifugation.
9. 한번 더 RPE buffer 를 500µl 넣어주고 같은 조건으로 centrifugation.
10. Flow-through 를 버리고, maximum speed 로 2분간 centrifugation.
11. 1.5ml collection tube 에 column 을 setting 하고 Rnase-free water 30µl 를 넣어준 후
10,000rpm 1min centrifugation 하여 elution 한다.
12. 여기에 Rnase-free water 20µl 를 넣어주고 2번째 elution 을 한다.
(한번에 50µl elution 하는 것보다, 두번에 나누어하는게 yield 가 더 좋다.)
13. 정량을 하거나, -20°C 에서 보관한다.
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