쉽게 따라할 수 있는 Hemacytometer (cell count) 를 이용한 세포수 측정법

Hemacytometer 를 이용한 세포수 측정 (cell counting) 이란?

 

Hemacytometer (혈구계수계) 를 이용한 세포수 측정방법은 혈액에서 다양한 혈액구성 세포 (적혈구, 백혈구, 혈소판 등)의 수를 측정하기 위해 개발되었다. 하지만, 생명과학 연구 분야에서 동물 세포를 배양하여 다양한 분자생물학적 실험을 진행하고자 할때 동일한 세포의 수를 기준으로 맞춰주기 위하여 세포의 수를 측정하는 방법으로 이용되고 있다.

Hemacytometer 는 혈구 계수계(혈구 계수계)라고도 하며, 측면이 돌출된 형태의 유리 챔버로, 챔버 바닥에서 정확히 0.1mm 위에 석영 커버슬립으로 고정합니다. 계수 챔버는 총 표면적이 9 mm^2 (그림 1 참조)로 에칭되어 있습니다.

그림 1. Hemacytometer 실물 모양 및 구조

 

농도 계산은 커버 슬립 아래의 부피를 기준으로 합니다.

큰 정사각형 하나(그림1. One square millimeter,  참조)의 부피는 0.0001ml(길이 x 너비 x 높이, 즉 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm)입니다.

 

세포를 염색하면 시각화 및 계수가 용이해지는 경우가 많습니다. (optional step)

1. 세포를 같은 양의 Trypan blue [트리판 블루 0.4%(w/v)] 를 PBS에 섞어 생존 세포 수를 확인(죽은 세포는 파란색),

2. 10% 포르말린으로 세포를 사멸시킨 다음 트리판 블루 또는 다른 염색약으로 염색합니다(모든 세포의 시각화를 개선하기 위해).

 

 

cell counting 방법

두가지 방법이 있습니다. (A, B 아래 설명 참조)

1.  모두 모세관 작용(Notch에 10ul drop 또는 주입) 의해 혈구 측정기 채움.

    -  잘 부유된 세포 혼합물로 채워진 피펫을 혈구 측정기 가장자리에 있는 노치에 놓은 다음 모세관 작용에 의해 액체가 챔버로 빨려 들어가도록 일부 내용물을 천천히 Tip (yellow) 끝으로 배출

 

 

2. 계산법 A / B 참조

방법의 선택은 세포 농도에 따라 달라지며, 절차의 정확도는 계수된 세포 수에 따라 달라집니다.

세포 농도가 낮으면 더 많은 그리드를 세어야 합니다.

2-1.  방법 A

바깥쪽 사각형 4개에 있는 셀의 개수를 세어봅니다 (그림 2의 왼쪽 패널 참조).
세포 농도는 다음과 같이 계산됩니다

밀리리터당 세포 농도 = 총 세포 수(4개 W에서 계수된 세포수 × 2500 × 희석 계수) 

 

예시: 세포 현탁액을 1:10으로 희석한 후 4개의 W 에서 총 450개의 세포를 세었다면,

원래 세포 농도 = 450 x 2500 (1 X 10^4 / 4) x 10(희석 비율) = 11,250,000/ml입니다.
※ 주의 사항 :  100~120 개의 cell count / W (최소 50개 이상 세포)

그림 2. cell counting 방법 A

## 간단하게 설명하면 ##

 총 세포수 (N/ml) = 1개의 W 에서 counting 된 세포수 X (1 X 10^4 개) X 희석 계수 ##

 

2-2. 방법 B  (작은세포)

큰 가운데 정사각형에서 5개의 정사각형을 세어 세포 농도를 추정합니다(그림 3).
세포 농도는 다음과 같이 계산됩니다:

 

밀리리터당 세포 농도 = 총 세포 수(5제곱 × 50,000 × 희석 계수)
예시: 세포 현탁액을 1:10으로 희석한 후 45개의 세포를 세었다면,

원래 세포 농도 = 45 x 50,000 (2.5 X 10^5 / 5) x 10 = 22,500,000/ml입니다.
※ 주의 사항 :  10~12개 cell count / R (최소 5개 이상 세포)

그림 3. cell counting 방법 B

## 간단하게 설명하면  ##

 총 세포수 (N/ml) = 1개의 R 에서 counting 된 세포수 X (5 X 10^4 개) X 희석 계수 

 

 

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즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!