Cell Apoptosis 란?
Cell apoptosis (세포고사)란 세포의 자발적인, 능동적인 세포사멸로, 프로그램된 세포사멸이라고도 합니다. 바이러스나 외부자극에 의한 DNA 손상 등으로 인해 불필요한 세포나 조직이 사라지는 과정입니다. 이 과정은 여러 가지 원인에 의해 유발되며, 세포 내부에서 일어나는 복잡한 신호전달 경로를 거쳐 진행됩니다. apoptotic cell은 DNA 단편화, 세포내 소기관(핵, 미토콘드리아 등)의 변화등의 다양한 특성을 갖습니다.
Apoptosis를 확인할 수 있는 실험 방법들로는 DNA fragmentation assay, TUNEL assay, AnnexinV staining, AnnexinV-PI staining FACS analysis 등이 있습니다. 제시한 네가지 방법에 대한 원리와 간략한 설명을 하겠습니다.
1. DNA fragmentation assay
세포가 apoptosis 과정에 진입하면, 엔도뉴클레아아제(Endonuclease)들이 DNA를 단절시켜서 작은 조각으로 만들어지는 것을 확인하는 실험방법입니다. Nucleosome (DNA+histone proteins)사이의 linker region에서 DNA가 절단되어 180-200 base pair 길이의 일정한 크기의 배수로 절단된 조각이 만들집니다. 이것을 Agarose 상에서 ladder pattern의 band로 확인할 수 있습니다. (그림참조)
실험방법은 링크를 클릭하시면 확인하실 수 있습니다.
(https://wookinfo.com/entry/DNA-fragmentation-assay-DNA-Ladder-assay)
2. TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) assay
TUNEL assay는 1. 번의 방법과 동일하게 세포내의 DNA 단편화를 검출하는 방법 중 하나입니다.
이 방법은 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)라는 효소와 dUTP라는 Nucleotide, 그리고 bio-tin이 부착된 ddUTP(2'-deoxyuridine-5'-triphosphate)를 이용하여, 세포가 프로그램된 세포사멸(apoptosis)과정에서 DNA가 단편화될 때 발생하는 DNA nucleic acid 3'-OH 말단에 bio-tin을 부착시켜 검출하는 방식입니다.
TdT 효소는 3'-OH 말단에 dUTP를 추가적으로 결합시켜서 DNA fragment 끝단에 bio-tin을 부착시켜줍니다. 그리고 나서 bio-tin이 부착된 DNA 단편을 avidin 혹은 streptavidin과 결합시키고, 시각화하기 위해 Streptavidin-horseradish peroxidase을 이용한 diaminobenzidine (DAB) 발색 또는 형광 (Streptavidin-FITC 등)을 이용합니다. (그림 참조)
실험방법은 링크를 클릭하시면 확인하실 수 있습니다.
(https://wookinfo.com/entry/TUNEL-assay-parafin-block-or-frozen-block)
3. Annexin V staining
Phosphatidylserine (PS, 인산이디실세린)는 원래 세포막 안쪽에 위치하고 있으나 apoptosis 가 시작되면 세포(세포막)밖으로 노출이 됩니다. 노출된 PS 와 강하고 특이적인 결합을 하는 Annexin V 를 사용하여 apoptosis 를 확인하는 방법이며(그림 참조), apoptosis 초기일때도 관찰 가능합니다.
검출 및 분석 방법은 ICC (Immunocytochemistry staining) 방법으로도 가능하지만, 대부분 FACS 를 사용하여 분석합니다.
실험방법은 링크를 클릭하시면 확인하실 수 있습니다. (링크.... 아직 작성중 ^^)
4. AnnexinV-PI staining FACS analysis
Cell cycle analysis 에 이용되는 propidium iodide(PI) 와 형광물질(FITC)가 라벨링된 Annexin V-FITC 용액으로 세포를 염색합니다. 3번에서 설명한 바와 같이 Annexin V는 PS에 결합하므로, 정상적인 상황에서는 세포막 내부에 위치한 PS와 결합하지 않습니다. 그러나 아포토시스가 발생하면, 세포막 내부의 PS가 외부로 노출되어 Annexin V와 결합합니다. 이때 PI 염색은 세포 손상 여부 (DNA 염색)를 확인하기 위해 사용됩니다.
결과적으로, Annexin V-FITC와 PI 양성세포는 아포토시스 후기 단계이며, Annexin V-FITC 만 염색된 세포는 초기/중기 아프로시스 단계이며, Annexin V-FITC와 PI 음성세포는 정상세포입니다.(그림 참조) 이렇게 염색된 세포를 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석하여 각각의 세포 상태를 확인할 수 있습니다.
검출 및 분석 방법은 ICC (Immunocytochemistry staining) 방법으로도 가능하지만, 대부분 FACS 를 사용하여 분석합니다.
실험방법은 링크를 클릭하시면 확인하실 수 있습니다. (링크.... 아직 작성중 ^^)
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즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!
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