DNA fragmentation assay (DNA Ladder assay)

DNA fragmentation assay 란?

세포에  아포토시스(apoptosis)가 일어나면 엔도뉴클레아아제(Endonuclease)들이 nucleosome (DNA+histone proteins)사이의 linker region에서 DNA가 절단되어 180-200 base pair 길이의 일정한 크기의 배수로 작은 조각으로 만들어지기 때문에 세포고사(apoptosis) 확인을 위한 실험 방법입니다. 

DNA fragmentation assay는 다양한 방법으로 수행될 수 있으나, 여기에서는 젤전기영동(gel electrophoresis)으로 확인 하는 방법을 서술하겠습니다.

 이 방법에서는 셀룰로오스나 아가로오스 등의 젤에 DNA 샘플을 올리고 전기장을 가하여 DNA 조각의 크기별로 분리하여 검출합니다.

 

 

Plants 2013, 2(1), 57-71; https://doi.org/10.3390/plants2010057 figure 7.발췌

○ DNA fragmentaion (Ladder) assay

 

→ preparation of reagents (buffer)

     - Lysis buffer 10mM Tris-HCl pH7.4

                           5mM EDTA

                           0.5% SDS

                           1 mg/ml protanase K

     - phenol-chloroform-isoamylalcohol(25:24:1)

     - 5M NaCl, 10ug glycogen, 100% EtOH, PBS

     - TE buffer (in RNase A 10ug/ml) 

     - 2ml E-tube (1.5 ml E-tube 이라면 EtOH 대신 1vol. IPA 사용)

 

 

                   

 

                                       

→ Procedure

1.  cell seeding and Cell treatment (+ control 반드시 포함, CPT, etoposide 등)
2.  cell harvest (1 X 10^6 ~ 10^7 cells / ml)
3.  centrifuge (400 x g ~800 x g, 10min)
4.  PBS washing (400 x g ~800 x g, 10min)
5. centrifuge (400 x g ~800 x g, 10min)
6. cell pellet + add Lysis buffer 0.5ml
7. incubation 37℃, 60min
8. add NaCl final conc. 1M (6번 cell pellet + 0.5 ml lysis buffer 에 100~120 ul 5M NaCl 첨가)
9. 4℃ overnight
10. centrifuge 15,000 x g, 30min, 4℃
11. supernatant : phenol-chloro-isoamylalcohol = 1 : 1 (약 600 ul  첨가 후 inverted hand mix, ※ Never vertexing)
12.  centrifuge 15,000 x g, 15min, 4℃
13. supernatant (약 500~600 ul), 10ug glycogen + 2 vol. EtOH (or 1 vol. IPA)  + 1M NaCl (가능하면 순서대로, pre mixture 해도 무방함)
14. 20~-80℃ 30min 이상 보관
15. centrifuge 15,000 x g, 15min, 4℃
16. 20ul TE buffer (in RNase A)
17. room temp. or 37℃ 30min
18. Agarose gel (1.5 ~ 2%) electrophoresis