TUNEL assay (parafin block or frozen block)

TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) assay 란?

TUNEL assay는 세포내의 DNA 단편화를 검출하는 방법 중 하나입니다. 이 방법은 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)라는 효소와 dUTP라는 뉴클레오티드, 그리고 bio-tin이 부착된 ddUTP(2'-deoxyuridine-5'-triphosphate)를 이용하여, 세포가 프로그램된 세포사멸(apoptosis)과정에서 DNA가 단편화될 때 발생하는 3'-OH 말단에 bio-tin을 부착시켜 검출하는 방식입니다.

 

 

Parafin block 과 Frozen block 을 사용한 조직의 TUNEL assay 방법은 전체적인 과정은 동일하다. 단지, 각 block 의 특징이 다르기 때문에 전처리 과정이 다르다. 자세한 내용은 Parfin block 및 slide 제작 (링크 참조, 작성중), Frozen block 및 slide 제작 (링크 참조, 작성중) 을 참조하길 바란다.

본 실험방법은 Parfin block 을 기준으로 작성되었음.

 

Ø  Chemicon ApopTaq Peroxidase In Situ Apoptosis detection Kit (Cat. No. S7100)

Ø  Washing buffer: PBS

 

https://www.rndsystems.com/resources/technical/tunel-assay-principle (R&D systems 홈페이지 발췌)

Fixation (Parafin block)

1.     Zinc fixatixing (BD pharmingen) 또는 4% formalin 을 sample cup에 넣고, 이곳에 tumor tissue를 넣는다

2.     4℃ shaker에서 조직을 24 hr 고정한다. .

     (조직의 크기에 따라 고정시간( 12h~5일)이 달라진다.)

 

Parafin section - slide 사용

 

Deparaffinization

(immunostaining jar set에 solution 250ml씩 넣는다)

3.      Xyrene 5 min X 3 times

4.      100% EtOH 5min

5.      90% EtOH 5min

6.      70% EtOH 5min

7.      흐르는 물에 5min 방치. rough하게 washing 한다.

 

TUNEL assay

8.      Proteinase K (20ug/ml) in PBS 15min. (re-use 사용 가능, storage -20도)

9.      흐르는 물에 rough하게 세척

10.   PBS washing  3min

11.   3% H2O2 in PBS 10 min

12.   흐르는 물에 5 min 방치. rough하게 수돗물을 틀어놓고 washing

13.   PBS washing  5min

14.   조직 주변을 깨끗하게 닦아내고, equilibration buffer를 30 ~ 75 ul 처리한다.

-       10 sec. (10초간 짧게 처리한다.)

15.   TdT enzyme 처리.  37℃에서 1 hrs (시간 엄수!)

       working strength TdT enzyme mixture 만듬:

          -         reaction buffer 77 ul + TdT enzyme 33 ul=total 110 ul

          Zinc fixative 용액으로 조직을 고정한 경우, 

          TdT enzyme 양을 1/10 희석하여 working strength TdT enzyme mixture를 만듬

          : reaction buffer 106.7 ul + TdT enzyme 3.3 ul=total 110 ul

16.   stop buffer 처리. working strength stop/wash buffer에 담궈서 15초 동안 강하게 세척하고, 10분 동안 RT에서 반응

       working strength stop/wash buffer 만듬: stop/wash buffer 1 ml + dH2O 34 ml

17.   PBS washing  5min

18.   조직 주변의 물기를 제거하고, anti-digoxigenin conjugate를 30 ~ 65 ul처리한다.

-       RT 30 min (시간 엄수!)

19.   PBS washing  3min

20.   DAB 발색: diluent 1ml + DAB 1 drop : 100 ul in each sample

       현미경을 보면서 발색 여부 확인.

21.   D.W.에 넣어서 반응을 정지시킨다.

22.   흐르는 물에 rough하게 washing

 

Counterstaining

23.   0.5% (w:v) methylgreen 용액에 10min 동안 counterstaining한다.

24.   흐르는 물에 rough하게 washing.

25.    100% n-butanol에 흔들면서 10회 dipping하고, 30초간 담근다.

       오래 담그면 methylgreen이 빠지므로, 색깔을 보면서 시간 엄수한다.

26.   xylene에 담근다.

27.   mounting

       mounting sol (xylene: permount = 1:1) 1 drop 후 cover glass 덮는다 (기포가 생기지 않도록 조심!!)

 

U343 untreated, CPT 3 uM (frozen block) from 작성자