플라스미드(Plasmid) DNA Midi-prep. Kits 란?
플라스미드 DNA를 이용하기 위해서는 박테리아 (E. coli) 에서 분리 정제하는 과정이 필요합니다만, 일반적으로 plasmid recombinant 를 위한 cloning 과정에서는 mini-prep 을 많이 사용하게 되지만, 세포나 박테리아에 형질 전환(transduction) 또는 형질도입(transformation) 등으로 발현 세포주 (stable cell line) 제작을 위해서는 대용량 및 고순도의 plasmid DNA (vector) 가 필요합니다.
따라서, 이러한 과정을 용이하게 하기 위해 대량의 E. coli 배양 산물 (50~100 ml)에서 plasmid DNA preperation (Prep.) 혹은 purification 을 하는 과정에서 필요한 kits 를 흔히 midi-prep. Kits 라 표현을 합니다. Mini-prep. kits 와 마찮가지로 국내외 다양한 회사(promega, invitrogen, Qiagen, GeneAll, CosmoGenetech 등)에서 판매하고 있으며, 상세한 방법은 각 제품마다 조금 차이가 있지만 많이 사용하는 QIAGEN 제품을 기준으로 소개하고자 합니다.
제가 생각하기에 QIAGEN 제품의 가성비는 좋지 않지만, 품질은 아직 다른 회사제품이 따라가지 못하는 듯 합니다. 또한, protocol 이 다소 난해한 경향이 있기때문에 핵심만 요약해서 정리하였습니다.
Required solution:
- QIAGEN plasmid Midi kits (25) (#12143): P1, P2, P3, QBT, QC, QF, and 100 column
Isoprophanol
70% ethanol(4℃ 보관)
TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0)
Procedure
1. LB medium containing antibiotics (E. coli, ampicillin (150㎍/㎖)) 100-200㎖
37℃에서 8-12시간 shaking incubation.
2. E.coli harvest: Centrifugation (6,000g or RPM, 15min, 4℃)
3. Buffer P1 (4~10 ml) bacterial pellet resuspension
=> Buffer P1은 RNase A를 넣고 4℃에 보관.
4. Buffer P2 (4~10 ml) 처리 후 4 ~ 6 회 가볍게 inverting하고 5 min incubation on RT.
5. Buffer P3 (4~10 ml) 처리 후 4 ~ 6회 가볍게 inverting하고 15 min incubation on ice.
=> sample이 많으면, Buffer P3 처리 후 1 by 1 으로 inverting.
6. Centrifugation (20,000g or 13,000rpm, 30min, 4℃)
7. Re-centrifugation (20,000g or 13,000rpm, 15min, 4℃)
8. Re-centrifugation가 끝날 무렵, Buffer QBT(4 ml)로 QIAGEN-tip 100를 equilibration.
9. Supernatant를 QIAGEN-tip에 넣어 filtering.
10. Wash the QIAGEN-tip with Buffer QC(10 ml) X 2
11. Elute DNA with Buffer QF (5 ml).
12. Eluted DNA에 isoprophanol(3.5 ml)를 처리 후 DNA를 precipitation. (15,000g or 13,000rpm, 30min, 4℃).
13. Pellet이 떨어지지 않도록 조심스럽게 supernatant를 버림
14. 70% ethanol(2㎖)로 DNA pellet을 washing (15000g, 10min, 4℃).
15. Pellet이 떨어지지 않도록 조심스럽게 supernatant를 버림.
16. 5-10min 정도 air-dry 시킨 후 적당한 volume (100~200 ul)의 TE buffer로 녹인다.
-->※주의 step에서 centrifuge 는 1번만 시행 후, supernatant 를 column 에 넣기 전에 3M paper 로 걸러서 사용할 것.
(눈에 보이지 않더라도 pellet 이 조금이라도 섞이면, column flow 가 무한대 시간이 걸림...해보면 알게됨!! ^^; )
* RNase 첨가 후 4℃ 보관
** Open 후 4℃ 보관, 사용 시 ice에 꽂아놓고 사용
*** TE Buffer - 10mM Tris (pH 8.0) / 1mM EDTA (pH8.0)
DNA 정량 방법 및 계산은 링크(클릭) 참고하세요. ^^
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즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!
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