Plasmid DNA preperation(purification) - 플라스미드 DNA 정제 방법 (manually methods)

플라스미드(Plasmid) DNA 란? 

플라스미드 DNA는 박테리아 및 일부 다른 유기체의 염색체 DNA와 분리된 일종의 원형 이중 가닥 DNA 분자입니다. 플라스미드는 일반적으로 크기가 몇 킬로베이스에서 수백 킬로베이스로 작으며 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있습니다.

전반적으로 플라스미드 DNA는 유전 연구 및 생명 공학에 중요한 도구이며 박테리아에서 자연적으로 발생하는 것은 항생제 내성의 확산과 미생물 군집의 진화에 중요한 의미가 있습니다. 인공적으로 제작된 플라스미드를 흔히 vector 또는 DNA vector 라고 표현하기도 합니다.

 

이러한 플라스미드의 특징을 이용하여 특정 유전자를 플라스미드에 삽입할 수 있으며 (이를 vector 라 표현함), 이를 박테리아 세포에 도입하여 원하는 유전자 산물을 발현하는 재조합 유기체를 생산할 수 있습니다.

또한 유전자 치료에서 치료 유전자를 세포에 전달하기 위한 벡터로 사용하거나 분자 생물학 연구에서 유전자 기능을 연구하기 위한 도구로 사용되고 있습니다.

 

이러한 플라스미드를 이용하기 위해서는 박테리아 (E. coli) 에서 분리 정제하는 과정이 필요합니다.

이러한 과정을 plasmid DNA preperation (Prep.) 혹은 purification 이라고 하며, 다양한 방법이 있으나 가장 대표적인 방법을 소개합니다.

 

Reagents; Buffer and Solution

Solution I: 50mM glucose

                 25mM Tris-Cl (pH 8.0)

                 10mM EDTA

Solution II: 0.2N NaOH

                    1% SDS

Solution III: 5M potassium acetate

                     Glacial acetic acid

TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH8.0

                  1 mM EDTA

100% Ethanol

70% Ethanol

Isopropanol

D.W containing 20㎍/ml RNase A

 

Sample: LB medium containing Antibiotics (ampicillin 50~150㎍/㎖) 1~10㎖

               ==> E.coli (including vector) incubate with shaking at 37℃ for 8-12 hr

 

Procedure

(1) Pick colony from plate by sterilized tooth pick and put into 15 or 50 ml cornical tube with 1ml ~ 10 ml of media, respectively. Overnight culture, 37℃ incubator.

(2) Take about 1.5ml into 1.5ml microtube.

(3) Centrifuge 8,000 rpm for 30 seconds.

(4) Discard medium and keep the pellet. (try to remove all the media)

 

(5) Resuspend pellet completely with 100ul resuspension solution (solution I) by pipeting or vortexing.

(6) Add 200 ul of lysis solution (solution II) and mix immediately by inverting tubes

      (※do not vortex) for 1-5min.

     *Make sure the mixture gets clear, which indicates that cells are totally disrupted. 

(7) Add 150 ul of neutralization solution (solution III) and mix immediately by inverting tubes for 1-5 minutes.

(8) Keep on ice, 5 ~ 10 min.

(8) Centrifuge 13,000rpm for 10min, 4℃.

 

(9) Pipet the supernatant (leave out the white pellet) and transfer into new microtube. 

(10) Add an equal volume of isopropanol.

(11) inverting ==> Store the tube on -20℃ / (or vortexing 5 seconds - author recommaned)

(12) Centrifuge 13,000rpm for 10min, 4℃

(13) Remove the supernatant. Add 700 ul of 70% ethanol.

(14) Centrifuge 13,000rpm for 10min, 4℃.

 

(15) Remove all of the supernatant. Remove any beads of ethanol that form on the sides of the tube. Store the open tube at room temperature until the ethanol has evaporated and no fluid is visible in the tube

(16) Dissolve the nucleic acids in 10~50 ul of D.W or TE

(17) DNA concentration is measured with OD260 or Store the DNA solution at -20℃

 

 

plasmid DNA prep. (manually methods)

DNA 정량 방법 및 계산은 링크(클릭) 참고하세요. ^^

 

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즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!