쉽고 간단한 competent cell (E.coli) 제작 방법입니다.
Competent cell (E. coli) 이란?
대장균의 형질전환 (plasmid transformation)방법에서 필요하며, 대장균의 세포벽을 침투하기 쉽도록 취약화 처리된 타입의 세포(competent cell)를 이용합니다. 사용할 competent cell은 DNA 삽입후 발현 및 유지 효율이 상이할 수 있으며, 일반적으로 다음과 같은 유형이 있습니다. 각각의 방법은 사용하는 대장균의 유형에 따라 상황에 맞게 선택이 가능합니다.
1. Calcium chloride-heat shock method (CaCl2 method): 대장균의 세포벽을 침투하기 위해 세포 벽의 취약성을 높이는 칼슘 염기처리를 시행하여 변환용 세포를 만드는 방법입니다. 이때 열 충격을 가해서 DNA를 세포 내로 유입시키는데 이 과정에서 DNA는 세포 내에서 해방되어 대장균의 염색체에 통합 되어 표현됩니다.
2. Electroporation: 전기적 충격을 이용하여 세포 벽을 취약화시켜 DNA를 대장균 내부로 유입하는 방법입니다. 전기적 충격은 DNA 분자를 세포 벽을 통과시켜 대장균 세포의 염색체에 삽입되어 대장균 내부에서 발현됩니다.
3. Gene gun: 입자 실험장치를 이용하여 DNA를 유전자 삽입 대상 세포내로 직접 발사해서 삽입하는 방법입니다.
Procedure (3일 소요)
1. E.coli Seed culture 1일차: 만들고자 하는 E. coli cell line을 LBA plate에 streaking 한 후 37°C 에서 1일 배양 (Top10-streptomycin R, DH5α 등. competent cell 종류는 링크 (클릭) 참조)
2. E.coli Seed culture 2일차: single colony pick up, 2ml LB에 seed culture (Overnight culture)
3. 2번 seed culture 한 것을 1~2 % volumn으로 LB에 media에 접종 (OD600 = 0.4~0.6 이 될 때 까지 키움)
(ex. 2ml seed culture ==> 100~200ml LB media)
##다음의 과정은 모두 ice에서 진행##
4. 4000 rpm, 5~10 min, 4°C에서 centrifuge
5. 상등액 버리고, *멸균수 (15ml) 넣고 tube를 ice에 꽃은 상태에서 cell을 풀어줌.
6. 4000 rpm, 5~10 min, 4°C에서 centrifuge
7. 상등액 버리고, *멸균수 (15ml) 넣고 tube를 ice에 꽃은 상태에서 cell을 풀어줌.
8. 4000 rpm, 5~10 min, 4°C에서 centrifuge
9. 상등액 버리고, 0.1 M Cacl2 (15ml) 를 넣고 tube를 ice에 꽃은 상태에서 cell을 풀어줌.
10. incubation in ice 15~30min**
11. 4000 rpm, 5~10 min, 4°C에서 centrifuge
12. Harvest된 cell의 양을 보고, 적당량 (4~6ml)** 최종 [0.1M Cacl2, 15~20% glycerol] 로 만들어서
100 µL 씩 1.5ml tube에 담은 후 액체 질소에 담근다. 그 후 -80°C 에서 보관
*0.1 CaCl2 또는 Inoue solution*** 사용 추천합니다. DW 는 E.coli 의 상태가 급격하게 나빠질 수 있습니다.
** 10번에서 incubation 하지 않고 12번에서 incubation 해도 상관 없고, 안해도 상관없습니다.
*** PIPES (0.25M) 8 ml, CaCl2 0.44g, KCl 3.54g, MgCl2 2.18g in 200ml DW ==> filtering
참고로, LB, LBA 조성 및 Antibiotic stock 농도 및 사용 농도입니다.
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즐거운 실험! 활기찬 실험실 생활 되세요. 홧팅!!!