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TUNEL assay (parafin block or frozen block) TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) assay 란? TUNEL assay는 세포내의 DNA 단편화를 검출하는 방법 중 하나입니다. 이 방법은 TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase)라는 효소와 dUTP라는 뉴클레오티드, 그리고 bio-tin이 부착된 ddUTP(2'-deoxyuridine-5'-triphosphate)를 이용하여, 세포가 프로그램된 세포사멸(apoptosis)과정에서 DNA가 단편화될 때 발생하는 3'-OH 말단에 bio-tin을 부착시켜 검출하는 방식입니다. Parafin block 과 Frozen block 을 사용한 조직의 TUNEL assay 방법은 전체적인 과정은 동일하다. 단지, 각 block 의 특.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 12. 5.
DNA fragmentation assay (DNA Ladder assay) DNA fragmentation assay 란? 세포에 아포토시스(apoptosis)가 일어나면 엔도뉴클레아아제(Endonuclease)들이 nucleosome (DNA+histone proteins)사이의 linker region에서 DNA가 절단되어 180-200 base pair 길이의 일정한 크기의 배수로 작은 조각으로 만들어지기 때문에 세포고사(apoptosis) 확인을 위한 실험 방법입니다. DNA fragmentation assay는 다양한 방법으로 수행될 수 있으나, 여기에서는 젤전기영동(gel electrophoresis)으로 확인 하는 방법을 서술하겠습니다. 이 방법에서는 셀룰로오스나 아가로오스 등의 젤에 DNA 샘플을 올리고 전기장을 가하여 DNA 조각의 크기별로 분리하여 검출합니다... 공감수 0 댓글수 0 2023. 12. 5.
Cell apoptosis를 확인하는 대표적인 4가지 실험 방법의 원리와 간단한 소개입니다 Cell Apoptosis 란? Cell apoptosis (세포고사)란 세포의 자발적인, 능동적인 세포사멸로, 프로그램된 세포사멸이라고도 합니다. 바이러스나 외부자극에 의한 DNA 손상 등으로 인해 불필요한 세포나 조직이 사라지는 과정입니다. 이 과정은 여러 가지 원인에 의해 유발되며, 세포 내부에서 일어나는 복잡한 신호전달 경로를 거쳐 진행됩니다. apoptotic cell은 DNA 단편화, 세포내 소기관(핵, 미토콘드리아 등)의 변화등의 다양한 특성을 갖습니다. Apoptosis를 확인할 수 있는 실험 방법들로는 DNA fragmentation assay, TUNEL assay, AnnexinV staining, AnnexinV-PI staining FACS analysis 등이 있습니다. 제시한 .. 공감수 0 댓글수 0 2023. 6. 9.
쉽게 따라할 수 있는 Hemacytometer (cell count) 를 이용한 세포수 측정법 Hemacytometer 를 이용한 세포수 측정 (cell counting) 이란? Hemacytometer (혈구계수계) 를 이용한 세포수 측정방법은 혈액에서 다양한 혈액구성 세포 (적혈구, 백혈구, 혈소판 등)의 수를 측정하기 위해 개발되었다. 하지만, 생명과학 연구 분야에서 동물 세포를 배양하여 다양한 분자생물학적 실험을 진행하고자 할때 동일한 세포의 수를 기준으로 맞춰주기 위하여 세포의 수를 측정하는 방법으로 이용되고 있다. Hemacytometer 는 혈구 계수계(혈구 계수계)라고도 하며, 측면이 돌출된 형태의 유리 챔버로, 챔버 바닥에서 정확히 0.1mm 위에 석영 커버슬립으로 고정합니다. 계수 챔버는 총 표면적이 9 mm^2 (그림 1 참조)로 에칭되어 있습니다. 농도 계산은 커버 슬립 아래.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 6. 2.
쉽고 간단한 competent cell (E.coli) 제작 방법입니다. Competent cell (E. coli) 이란? 대장균의 형질전환 (plasmid transformation)방법에서 필요하며, 대장균의 세포벽을 침투하기 쉽도록 취약화 처리된 타입의 세포(competent cell)를 이용합니다. 사용할 competent cell은 DNA 삽입후 발현 및 유지 효율이 상이할 수 있으며, 일반적으로 다음과 같은 유형이 있습니다. 각각의 방법은 사용하는 대장균의 유형에 따라 상황에 맞게 선택이 가능합니다. 1. Calcium chloride-heat shock method (CaCl2 method): 대장균의 세포벽을 침투하기 위해 세포 벽의 취약성을 높이는 칼슘 염기처리를 시행하여 변환용 세포를 만드는 방법입니다. 이때 열 충격을 가해서 DNA를 세포 내로 유입시키는.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 5. 22.
대장균 형질전환 실험 방법 (E.coli Transformation) - DH5α/CaCl2 methods 기준입니다. 플라스미드(plasmid) 를 이용한 대장균의 형질전환 (E. coli Transformation) 플라스미드(plasmid)는 세균 내 유전자 DNA 조각입니다. 이 작은 조각들이 세포 안에서 복제되어 증식하게 되면 생명체처럼 행동하기 시작하는데 이를 형질전환(transformation)이라고 합니다. 플라스미드(plasmid)는 대장균에 외부 유전자를 삽입하기 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 하나입니다. 플라스미드를 이용하여 대장균에 유전자를 삽입함으로써 다음과 같은 분자생물학적 의의를 갖습니다. 대장균 내 유전자 삽입 기술은 생명공학 분야에서 중요한 의미를 가지며, 연구 분야에 있어서 매우 유용하게 사용됩니다. 1. 외부 유전자의 대장균 내 전파 - 플라스미드를 이용하여 외부 유전자를 대장균으로 .. 공감수 0 댓글수 0 2023. 5. 22.
Two-color ImmunoCytoChemistry staining (2 color- ICC 염색)- Rapid/simple methods 입니다. ICC staining 이란? 일반적으로 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining)을 수행하는 목적은 세가지 입니다. 첫번째는 타겟 단백질의 세포내 위치 확인하기 위해서, 두번째는 발현시킨 외부유전자의 발현을 확인하기 위해서, 마지막으로 "세번째는 2가지 이상의 단백질의 상호간 관련성 (interaction)을 확인 및 검증"하는 것입니다. 물론, 한꺼번에 모두 확인할 수도 있습니다. 대부분의 실험은 부착세포에서 세포내 / 핵 단백질을 염색하는 방법 입니다 (링크 참조). 그리고, 세포의 상태와 염색하고자 하는 단백질의 세포내 위치에따라 현탁액에서 고정되지 않은 세포에 표면 단백질 염색방법 (FACS 적용가능) (링크참조) 과 부착 또는 부유 세포의 표면 항원의 형광 염색방법 (.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 5. 19.
QIAGEN plasmid midi-prep. kits 사용, 실험 방법 요약입니다. 플라스미드(Plasmid) DNA Midi-prep. Kits 란? 플라스미드 DNA를 이용하기 위해서는 박테리아 (E. coli) 에서 분리 정제하는 과정이 필요합니다만, 일반적으로 plasmid recombinant 를 위한 cloning 과정에서는 mini-prep 을 많이 사용하게 되지만, 세포나 박테리아에 형질 전환(transduction) 또는 형질도입(transformation) 등으로 발현 세포주 (stable cell line) 제작을 위해서는 대용량 및 고순도의 plasmid DNA (vector) 가 필요합니다. 따라서, 이러한 과정을 용이하게 하기 위해 대량의 E. coli 배양 산물 (50~100 ml)에서 plasmid DNA preperation (Prep.) 혹은 purifi.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 5. 2.
Plasmid DNA mini-prep.(purification) - 전용 Kits 사용 방법 요약 플라스미드(Plasmid) DNA prep. Kits 란? 플라스미드 DNA를 이용하기 위해서는 박테리아 (E. coli) 에서 분리 정제하는 과정이 필요하고, 이러한 과정을 plasmid DNA preperation (Prep.) 혹은 purification 이라고 하며, 이를 위한 prep. Kits 를 국내외 다양한 회사(promega, invitrogen, Qiagen, GeneAll, CosmoGenetech 등)에서 판매하고 있으며, 상세한 방법은 각 제품마다 조금 차이가 있지만 전반적인 방법에 대해 소개하고자 합니다. 플라스미드 DNA는 박테리아 및 일부 다른 유기체의 염색체 DNA와 분리된 일종의 원형 이중 가닥 DNA 분자입니다. 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 플라스미드 DN.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 5. 2.
Plasmid DNA preperation(purification) - 플라스미드 DNA 정제 방법 (manually methods) 플라스미드(Plasmid) DNA 란? 플라스미드 DNA는 박테리아 및 일부 다른 유기체의 염색체 DNA와 분리된 일종의 원형 이중 가닥 DNA 분자입니다. 플라스미드는 일반적으로 크기가 몇 킬로베이스에서 수백 킬로베이스로 작으며 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있습니다. 전반적으로 플라스미드 DNA는 유전 연구 및 생명 공학에 중요한 도구이며 박테리아에서 자연적으로 발생하는 것은 항생제 내성의 확산과 미생물 군집의 진화에 중요한 의미가 있습니다. 인공적으로 제작된 플라스미드를 흔히 vector 또는 DNA vector 라고 표현하기도 합니다. 이러한 플라스미드의 특징을 이용하여 특정 유전자를 플라스미드에 삽입할 수 있으며 (이를 vector 라 표현함), 이를 박테리아 세포에 도입하여 원하는 유전.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 5. 2.
Cell viability (세포 생존율) 측정 방법 - MTT assay 실험 방법으로 확인 해 봅시다. MTT assay 의 원리 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 는 정상적으로 살아있는 혹은 증식하는 세포(대사과정이 온전한 세포)에서는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의해 수용성의 노란색 MTT 를 비수용성의 MTT formazan (자주색)으로 환원시키게 됩니다. 비수용성인 MTT foramazan을 DMSO 또는 DMF 에 용해시켜 흡광도를 측정할때 파장은 540 nm이며, 측정된 흡광도가 높을 수록 살아있고 대사적으로 왕성한 세포임을 나타냅니다. 장점 : 1) sensitive, 2) accurate, 3) safety, 4) easy & rapid, 5) semiautomatic 등이 있습니다. ※ 1. MTT .. 공감수 0 댓글수 0 2023. 4. 26.
ICC staining 실험 중 가장 어려운 "부착 세포의 표면 단백질 형광 염색" 방법입니다. ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining) 방법은 다음과 같은 3가지 방법으로 수행합니다. 대부분의 실험은 "부착세포에서 세포내 / 핵 단백질을 염색하는 방법 " 입니다 (링크 참조). 그리고, 현탁액에서 고정되지 않은 세포에 표면 단백질 염색방법 (FACS 적용가능) 으로 링크를 클릭하시면 확인하실 수 있습니다. 마지막은 지금 설명드릴 “부착 세포의 표면 단백질의 형광 염색” 방법입니다. 간단하게 소개하고, 세부적인 설명을 추가해서 요약하도록 하겠습니다. 일반적으로 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining)을 수행하는 목적은 세가지 입니다. 첫번째는 타겟 단백질의 세포내 위치 확인하기 위해서, 두번째는 발현시킨 외부유전자의 발현을 확인하기 위해서, 마지.. 공감수 0 댓글수 0 2023. 4. 25.
쉽게 할 수 있는 ICC staining 실험 - 세포 표면 단백질 염색 방법 일반적으로 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining)을 수행하는 목적은 세가지 입니다. 첫번째는 타겟 단백질의 세포내 위치 확인하기 위해서, 두번째는 발현시킨 외부유전자의 발현을 확인하기 위해서, 마지막으로 세번째는 2가지 이상의 단백질의 상호간 관련성 (interaction)을 확인 및 검증하는 것입니다. 물론, 한꺼번에 모두 확인할 수도 있습니다. 세포 배양 / 성장 형태, 즉 부유 / 부착 (suspension / adhesion) 세포에 따라, 그리고 타겟 단백질의 발현 위치(세포내)에 따라 적용되는 실험 방법이 조금씩 다릅니다. 이번에는 “현탁액에서 고정되지 않은 세포에 표면 단백질 염색방법” (FACS 적용가능)을 설명합니다. 현탁액에 고정되지 않은 세포 표면 단백질 .. 공감수 1 댓글수 0 2023. 4. 25.
초보 연구자들도 쉽게 할 수 있는 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining) 실험 방법 - 요약 및 정리 오늘은 in vitro 실험에서 빠질 수 없는 ICC 염색 (ImmunoCytoChemistry Staining) 실험 방법을 소개하고 설명 및 요약하도록 하겠습니다. 실험 목적은 아래와 같습니다. 1. 일반적으로 타겟 단백질이 세포내 어느 위치에 존재하는지 확인 2. 외부 유전자를 발현시킨 단백질에 제대로 발현하는지 확인 3. 단백질 상호간의 관련성 (interaction) 을 확인 4. 1,2,3 번 모두를 동시에 확인 및 검증 실험방법은 아래 세가지 조건에 따라 조금씩 다릅니다. 참고하시기 바랍니다. 1. 세포 배양/성장 형태, 즉 부유 / 부착 (suspension / adhesion) 세포에 따라 적용되는 방법 2. 대상 단백질의 세포내 (혹은 예상되는) 위치가 세포질 / 핵 / 세포막 (cyt.. 공감수 1 댓글수 0 2023. 4. 13.
PBS buffer (pH 7.0~8.0) 쉽게 만들어 봅시다~^^ Phosphate-buffered saline (PBS) - 사용하는 용도에 따라 D-PBS, PBS (-), PBS (+) 등의 종류가 다양하지만, 실험결과에 큰 영향을 주는 경우는 없음. - 사용상 [반드시 D-PBS 를 사용] 이라는 caution 이 없는 경우 구분없이 사용해도 무방하다. 1. 일반적인 PBS 제조 방법 (pH meter 로 보정) 1X PBS 8 g NaCl 0.2 g KCl 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 in 800 ml of distilled H2O. Adjust the pH to 7.4 with HCl. (1N or 3N HCl 사용, 한방울씩 천천히 추가할 것) Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclave. 10X PB.. 공감수 1 댓글수 0 2023. 1. 17.
PCR-Uracil 을 이용한 Site-directed mutagenesis 실험 방법 정리 Site-directed mutagenesis Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열을 변화시켜, 어떤 단백질의 기능부위를 연구할 때에 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 혹은 제거한 다음 기능의 변화를 관찰함으로써 기능부위를 규명할 수 있는 분자생물학에서 중요하게 이용되는 분야이다. DNA 재결합시 필요한 제한효소 절단부위를 만들거나 소실시킬 때 사용하기도 함. promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화 시켜서 결합을 못하게 한 다음 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting factor의 중요성을 타진할 수도 .. 공감수 0 댓글수 0 2023. 1. 17.
PCR-4primers 를 이용한 Site-directed mutagenesis 실험 방법 정리 Site-directed mutagenesis Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열을 변화시켜, 어떤 단백질의 기능부위를 연구할 때에 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 혹은 제거한 다음 기능의 변화를 관찰함으로써 기능부위를 규명할 수 있는 분자생물학에서 중요하게 이용되는 분야이다. DNA 재결합시 필요한 제한효소 절단부위를 만들거나 소실시킬 때 사용하기도 함. promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화 시켜서 결합을 못하게 한 다음 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting factor의 중요성을 타진할 수도 .. 공감수 0 댓글수 0 2023. 1. 17.
Cell cycle analysis [FACS - PI staining] 실험 방법 정리 @ Cell cycle analysis 란? (자세한 설명은 생략) - 세포내 DNA 를 PI 로 염색하여 FACS로 분석하는 방법 I. preparation of PI staining - Wahing buffer : 2% FBS in PBS (or 2% BSA in PBS) / PBS 만 사용 가능 - 1.12% sodium citrate buffer (pH 8.5) - RNase A (50ug/ml in 1.12% sodium citrate buffer pH 8.5) - PI solution (BD Pharmingen Cat. #550825) * PI solution 조성 (만들어 사용 가능) PI 50 ug/ml (stock sol. 5 mg/ml) Sodium citrate 0.1 % (stock.. 공감수 0 댓글수 3 2023. 1. 17.
PCR-Dpn I 을 이용한 Site-directed mutagenesis 실험 방법 정리 Site-directed mutagenesis Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열을 변화시킴을 의미하는, 분자생물학에서 중요하게 이용되는 분야이다. 즉 어떤 단백질의 기능부위를 연구할 때에 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 혹은 제거한 다음 기능의 변화를 관찰함으로써 기능부위를 규명할 수 있다. 또 DNA 재결합시 필요한 제한효소 절단부위를 만들거나 소실시킬 때 사용되기도 한다. 또한 promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화 시켜서 결합을 못하게 한 다음 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting facto.. 공감수 0 댓글수 0 2022. 12. 6.
RT-PCR (Revers Transcription PCR) 실험 방법 정리 RT-PCR (Revers Transcription PCR) 이란? 생물학적 샘플 (세균, 세포, 조직, 바이러스 등) 에서 특정 RNA 분자를 검출하고 정량화하는 데 널리 사용되는 실험실 기법입니다. RNA 분자가 역전사라는 과정(역전사 효소를 사용하여)을 통해 상보적 DNA(cDNA)로 합성되고결과물인 cDNA는 원본 RNA 분자의 안정적인 사본 역할을 하며 검출을 위해 쉽게 증폭할 수 있습니다. 다음과 같은실험에 응용할 수 있습니다. 1. 특정 단백질의 RNA 수준 (mRNA; transcription) 에서의 발현량 확인 2. 특정 단백질을 암호화하고 있는 gene 또는 mRNA 의 분리 3. 특정 시료를 처리한 후 특정 단백질의 mRNA 수준에서의 발현량 비교 등 원리는 옆 그림을 참조하세요. .. 공감수 0 댓글수 0 2022. 12. 6.
RNA 정량 (RNA 농도 측정) 방법 및 요약 정리 DNA, RNA 정량 방법 (UV-Vis spectrophotometer 사용) 분리 정제된 DNA 또는 RNA 를 정량할 수 있는 방법으로 UV 파장대 (260/280nm) 의 흡광도를 측정하여 제시된 계산식에 의해 농도(ug/㎖ or ng/㎕)을 산출할 수 있다. 분리 정제된 DNA, RNA 는 실험실 수준의 UV-Vis spectrophotometer 또는 nano-drop 장비로 측정이 가능하지만, ssDNA, ssRNA, oligomer 등은 산출은 가능하지만, 정확한 계산 또는 측정의 오차가 있으므로 해당 장비보다 정밀하고 고가의 장비를 사용하는 것을 추천한다. 참고로, RT kits 로 합성된 cDNA 의 농도는 측정 할 수 없으므로 합성 전 사용된 total RNA 의 양을 기준으로 실험을.. 공감수 0 댓글수 0 2022. 12. 6.
RNA purification (RNA 정제) 어렵지 않아요~! 실험 진행 시 주의 사항 핵심 정리 요약입니다. RNA (Ribonucleic acid) 란? 특징 및 구성은 아래와 같다. - 전형적인 포유동물세포는 세포당 약 10-5 μg의 RNA를 함유하고 있다. - ribosomal RNA (주로 28S, 18S, 5S) 80∼85% - 여러 종류의 소분자 RNA(transfer RNA, small nuclear RNA 등) 10∼15% - mRNA는 세포내 전체 RNA중 1∼5% 정도로 크기(수백개에서 수천개 염기)와 염기배열 순서가 다양하며, 거의 모든 포유동물의 mRNA에는 3'쪽 끝에 poly(A) tail이 있어 oligo(dT) cellulose를 이용한 affinity chromatography로 순수 분리할 수 있다. RNase의 작용 최소화 - RNase 는 온도, pH 등의 극한 환경에서도 .. 공감수 0 댓글수 0 2022. 12. 6.
누구나 할 수 있는 동물 세포 배양 방법 (Cell culture) 정리 - 처음부터 끝까지 요약! 동물세포 (animal cell) 배양(culture ) 방법 : 동물 세포 배양은 다양한 과학 및 생명공학 분야에서 여전히 중요한 도구로 사용되고 있으며, 해당 분야의 기술과 지식이 발전함에 따라 그 응용 분야가 지속적으로 확대되고 있습니다. 동물 세포 배양에 대한 몇 가지 일반적인 사항은 다음과 같습니다. 세포주: 동물 세포주는 배양에서 지속적으로 증식할 수 있도록 불멸화 또는 변형된 세포입니다. 배지 및 배양 조건: 동물 세포는 성장을 위해 영양분이 풍부한 특정 배지와 적절한 온도, pH, 습도 등 환경 조건이 필요합니다. 무균 상태: 동물 세포 배양에서는 세포의 생존력과 무결성에 영향을 줄 수 있는 박테리아, 곰팡이 또는 기타 미생물에 의한 오염을 방지하기 위해 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니.. 공감수 0 댓글수 0 2022. 12. 1.
내피세포(Endothelial Cell) 배양이 어렵나요? 참고해 보세요 ^^ "내피세포 배양 방법 핵심 정리" 내피세포 (Endothelial Cell) 란? - 혈관 및 림프관의 내벽을 덮고 있는 단층의 편평세포로 세포질이 적고, 혈관의 장축 방향으로 긴 타원형의 핵을 갖고 있다. 내피세포의 내강면은 평활하며, 세포의 외측면(線)에서 서로 견고하게 결합하고 있어 인접하는 세포는 서로 겹치는 부분을 볼 수가 있다. Endothelial Cell line 의 종류 - 혈관으로부터 분리되어 세포주로 사용되고 있다. ; Large vessel (Aorta 대동맥, Artery 동맥, Vein 정맥) / Small vessel (Capillary 모세혈관) - 사람의 분리된 혈관 조직에 따른 세포주의 이름 및 약어 목록은 다음과 같으며, 혈관 세포주 또는 정상 세포주를 사용해야 하는 실험은 대부분 13. HuVEC 세포.. 공감수 0 댓글수 0 2022. 12. 1.

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