세파계 항생제 생산을 위한 인공 효소 개발 (석사 요약)

세파계 항생제는 Acremonium crysogenium 의 발효산물인 cephalos-porin C(CPC)를 정제하여 화학적 방법이나 효소 처리 방법으로 7번 위치의 aminoadipyl 기를 제거한 7-aminocephalosporanic acid(7-ACA)를 만든 다음(deacylation), 이 7-ACA를 기본물질로 하여 반합성 항생제를 제조하고 있다. 

효소에 의한 CPC 생변환 방식은 수용액상에서 반응이 진행되기 때문에 CPC 의 분리 정제 공정이 필요 없고, 또 유해한 화공약품을 사용하지 않으므로 폐수 처리를 위한 특수 시설이 불필요하여 7-ACA 생산 단가를 낮출 수 있는 장점이 있다.

 

연구의 목적 및 방법

본 연구의 목적은 D-amino acid oxidase(DAAO) 효소를 이용한 glutarly 7-aminocephalosporanic acid(GL-7ACA) 생산을 위한 산소공급 문제를 해결하기 위해 Vitreoscilla hemoglobin(VHb) 유전자를 DAAO 효소 유전자와 융합하여 새로운 인공효소를 개발하는것이다.

 

DAAO 효소에 의한 CPC 생물 전환반응에서 산소는 GL-7ACA 의 생산량을 결정하는 중요한 환경인자이다. CPC 생물 전환 반응에서 요구되는 산소 공급 문제를 해결하기 위하여 VHb 유전자와 DAAO 유전자의 융합을 시도하였다. VHb 유전자와 R. gracilis DAAO 유전자의 융합 유전자(VHb-rDAAO)를 증폭하여 pALTER-EX2 vector 에 삽입하였다.

R. gracilis DAAO 유전자가 삽입된 vector(pKR) 와 VHb-rDAAO 융합 유전자가 삽입된 vector(pERVD2)를 E. coli(JM109 DE3)에서 발현시켜 DAAO 효소 반응에 의해 생성되는 H2O2 의 양으로 효소 활성을 측정하였다. 재조합 균주 pKR 과 pERVD2를 각 3L 씩 배양한 후 french press를 이용하여 세포 추출액을 얻었으며, DEAE-Sephadex fast flow ion-exchange chromatography를 사용하여 부분정제 하였다.

CPC 에 대한 효소활성이 세포 추출액에서는 VHb-rDAAO 인공효소가 control 인 R. gracilis DAAO 보다 4배정 우수한 것을 확인하였다. 효소를 부분정제 하여 polyacrylamide gel 에 고정하였을 경우에 stirred tank reactor에서 4배, packed-bed reactor에서 12배정도 효소 활성이 더 우수하였다.

 

"Vitreoscilla Hemoglobin 유전자와 Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase 유전자의 융합에 의한 인공효소 개발"

1998.12. 저자 본인 --발췌--